顯然，CT值取決于域值。域值的量化定義是基線范圍內(nèi)熒光信號強度標準偏差的10倍。實驗操作中，域值范圍定義是從第3個循環(huán)起到CT值前3個循環(huán)止，其終點要根據(jù)每次實驗的具體數(shù)據(jù)調(diào)整(前2個循環(huán)熒光信號太弱，扣除背景后的校正信號往往波動比較大；而在CT值前3個循環(huán)大多數(shù)情況下熒光信號已經(jīng)開始增強，超過了基線高度)。從圖1的重復(fù)實驗中可以直觀地看到，隨著PCR反應(yīng)過程，熒光信號從基線經(jīng)一個轉(zhuǎn)折點進入指數(shù)期、線性期和終的平臺期，盡管平臺期DNA拷貝數(shù)波動很大，CT值卻是相對固定的。如果用不同濃度模版DNA作PCR，可以看出模版濃度越高，CT值越小。模版濃度每增加1倍，CT值減小1個循環(huán)。CT值與模板DNA的起始拷貝數(shù)成反比。這一結(jié)論可以從數(shù)學(xué)上嚴格證明。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)?！ ?/div>
模板定量可分為相對定量和定量。定量指的是用已知量的標準品作標準曲線來推算未知的樣本的量。質(zhì)粒DNA常作為定量標準品的制備之用。標準品的量可根據(jù)260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量來轉(zhuǎn)換成其拷貝數(shù)來確定。相對定量指的是在樣本中目標序列相對于另一參照樣本的量的變化。即參照物是1*的樣本，其它的樣本為參照物量的n倍。可以通過標準曲線法或者比較CT法進行相對定量，前者和定量相似，后者運用了數(shù)學(xué)公式來計算相對量，前提是假設(shè)每個循環(huán)增加一倍的產(chǎn)物數(shù)量，在PCR反應(yīng)的指數(shù)期得到CT值來反應(yīng)起始模板的量，一個循環(huán)（CT=1）的不同相當于起始模板數(shù)2倍的差異。但是此方法是以靶基因和內(nèi)參照的擴增效率基本一致為前提的，效率的偏移將影響實際拷貝數(shù)的估計?！ ?/div>
無論定量還是相對定量，在得到實驗結(jié)果后，還要考慮數(shù)據(jù)之間的可比性問題。在實驗操作中，取樣都是以體積或重量為單位的，但是同樣體積或重量的樣本所來源的細胞數(shù)目并不一樣，所以拷貝/μL或拷貝/ng的定量數(shù)據(jù)相互之間實際上并不可比。只有將這些數(shù)據(jù)歸一到以拷貝/細胞或拷貝/基因組為單位后，才可進行嚴格意義上的比較。這種校正可以通過適當?shù)膮⒈葋硗瓿?。參比一般選用b-actin、GAPDH、rRNA基因等管家基因。由于它們在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)是恒定的，受環(huán)境因素影響較小，其定量結(jié)果代表了樣本中所含細胞或基因組的數(shù)量。為了減少誤差，目標基因和參比基因好在同一反應(yīng)管內(nèi)同時進行定量測定，所以這種對照稱為陽性內(nèi)對照(InternalPositiveControl，IPC)。要進行IPC歸一化校正，
定量PCR儀必須具備多色檢測能力，好是4色。否則，目標基因和參比基因只能分兩管作定量，就不成其為“內(nèi)”標了。
定量實驗與定性實驗大的不同，是要考慮統(tǒng)計學(xué)要求并對數(shù)據(jù)進行嚴格的校正，以消除偶然誤差。因此重復(fù)實驗和設(shè)立各種對照非常重要。這一點在實踐中往往被輕視或忽視。定量實驗，誤差是不可避免的。設(shè)立重復(fù)實驗，對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，可以將誤差降低到小。所以定量實驗的每個樣本至少要重復(fù)3次以上，嚴格的定量更應(yīng)當重復(fù)6～8次，以滿足小樣本統(tǒng)計的要求。如果作定量，則標準曲線需要在5個點以上。標準曲線使用的標準品是濃度已知的DNA樣本，雖然可以自己制備，為標準化以及發(fā)表文章起見好購買商品化的標準品。標準曲線的反應(yīng)條件應(yīng)當與樣本*一致，以便準確定量。
服務(wù)熱線： 
