1、光度法測(cè)定的條件：分光光度法測(cè)定物質(zhì)含量時(shí)應(yīng)注意的條件主要是顯色反應(yīng)的條件和測(cè)定吸光度的條件。顯色反應(yīng)的條件有顯色劑的用量，介質(zhì)的酸度、顯色時(shí)溫度、顯色時(shí)間及干擾物質(zhì)的消除方法等；測(cè)量吸光度的條件包括入射光波長(zhǎng)的選擇、吸光度范圍和參比溶液等。

 

2、二氮雜菲-亞鐵絡(luò)合物：鄰二氮雜菲是測(cè)定微量鐵的一種較好的試劑。在pH=2～9的條件下Fe2+離子與鄰二氮雜菲生成穩(wěn)定的橘紅色絡(luò)合物，此絡(luò)合物的lgK穩(wěn)=21.3,摩爾吸光系數(shù)ε510=1.1×104在顯色前，首先用鹽酸羥胺把Fe3＋離子還原為Fe2＋離子，其反應(yīng)式如下：2Fe3＋+2NH2OH·HCl→2Fe2＋+N2+2H2O+4H++2Cl-測(cè)定時(shí)，控制溶液酸度在pH=5左右較為適宜。酸度過高，反應(yīng)進(jìn)行較慢；酸度太低，則Fe2+離子水解，影響顯色。Bi3+，Cd2+，Hg2+，Ag+，Zn2+等離子與顯色劑生成沉淀，Ca2+，Cu2+，Ni2+等離子與顯色劑形成有色絡(luò)合物。因此當(dāng)這些離子共存時(shí)，應(yīng)注意它們的干擾作用。

 

二、分光光度計(jì)測(cè)定微量鐵試劑

 

    10µg/mL的鐵標(biāo)準(zhǔn)液；鹽酸羥胺固體及10%溶液（因其不穩(wěn)定，需臨時(shí)用時(shí)配）；0.1%鄰二氮雜菲（新配制）；1mol/LNaAc溶液。

 

三、標(biāo)準(zhǔn)鐵的制備

 

    稱取0.7022g硫酸亞鐵銨[Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O],溶于70ml硫酸溶液中,滴加0.02mol/L的高錳酸鉀溶液至出現(xiàn)微紅色不變,用純水定容至1000ml。此貯備溶液1.00ml含0.100mg鐵。

 

四、指示劑的選擇

 

    原則指示劑也有酸堿性，指示劑一般是有機(jī)物，酸堿濃度太大有可能破壞指示劑（少數(shù)），而且濃度太高你每一滴里的酸堿就多，不可能恰好滴合適的酸堿，總是要多半滴，濃度越高差的越多是根據(jù)所需要的PH值的確定的，其值在所選擇的指示劑的突越范圍內(nèi)。這樣溶液才能夠有顏色的變化，才能夠判斷終點(diǎn)。

 

五、步驟

 

1、吸收曲線的繪制準(zhǔn)確

 

   移取10µg/mL鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液5mL于50mL容量瓶中，加入10%鹽酸羥胺1mL，搖勻，稍冷，加入1mol/LNaAc溶液5mL和0.1%鄰二氮雜菲3mL，以水稀釋至刻度，在分光光度計(jì)上，用1cm比色皿，以水為參比溶液，用不同的波長(zhǎng)從430nm開始到570nm為止，每隔10nm或20nm測(cè)定一次吸光度。然后以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制吸收曲線，從吸收曲線上確定該測(cè)定的適宜波長(zhǎng)。

 

2、鐵含量的測(cè)定

 

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取50mL容量瓶（或比色管）6支，分別移取2mL、4mL、6mL、8mL，鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液于5支容量瓶中，另一容量瓶中不加鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液（配制空白溶液，作參比）。然后各加入1mL10%鹽酸羥胺，搖勻，經(jīng)2min后，再各加5ml1mol/LNaAc溶液及3ml0.1%鄰二氮雜菲，以水吸稀釋至刻度，搖勻。在分光光度計(jì)上，用1cm比色皿，在大吸收波長(zhǎng)（510nm）處，測(cè)定各溶液的吸光度。以鐵含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 

（2）未知液中鐵含量的測(cè)定：分別二次吸取10mL未知液代替標(biāo)準(zhǔn)溶液，其它步驟均同上，測(cè)定吸光度。由未知液的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出10mL未知液中的鐵含量，然后以每毫升未知液中含鐵多少微克表示結(jié)果。

 

3、繪制吸收曲線

 

六、未知鐵量的測(cè)定  

 

    測(cè)的各標(biāo)液的吸光度，畫標(biāo)準(zhǔn)曲線；再根據(jù)未知鐵液的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出對(duì)應(yīng)的鐵量，進(jìn)而求未知溶液中鐵的含量。

 

七、微量分光光度計(jì)的使用  

 

    分光光度法測(cè)量的理論依據(jù)是朗伯-比耳定律：當(dāng)一束單色光通過一定濃度的稀有色容液時(shí)，溶液對(duì)光的選擇吸收程度A與溶液的濃L度或液層成正比即A=kcL=log(I0/I),式中：A為吸光度，表示光通過溶液時(shí)被吸收的強(qiáng)度；為有色溶液的濃度；I0為入射光強(qiáng)度；I為透射光強(qiáng)度；L為液層的厚度；為k吸光系數(shù)，它與入射光的波長(zhǎng)及溶液的性質(zhì)、溫度等有關(guān)。當(dāng)入射光強(qiáng)度I0、吸光系數(shù)k和溶液厚度L不變時(shí)，透射光強(qiáng)度I只隨溶液中物質(zhì)的量C而變化。因此，如果把通過溶液的光線通過測(cè)光機(jī)構(gòu)中的光電轉(zhuǎn)換接受器，并轉(zhuǎn)換成電能，在微電計(jì)上就讀出相應(yīng)的透光率，從而推算出溶液濃度。        

 

八、微量分光光度計(jì)使用注意事項(xiàng)

 

1、儀器預(yù)熱后，開始測(cè)量前反復(fù)調(diào)透光率0%和透光率100%。

2、儀器連續(xù)使用不應(yīng)超過2h，否則，好間歇0.5h后再使用。

3、比色皿洗滌必須干凈，拿取比色皿時(shí)，只能用手捏住毛玻璃的兩面，裝待測(cè)液時(shí)，應(yīng)用待測(cè)液潤(rùn)洗2-3次，保證待測(cè)液濃度不變，倒入的溶液應(yīng)在2/3-3/4處而不要太滿，放時(shí)應(yīng)將透光面對(duì)著光路。

4、比色皿要根據(jù)溶液顏色的深淺選擇厚度。

5、實(shí)驗(yàn)完后用的洗滌液以及蒸餾水洗凈晾干后存放在比色皿盒內(nèi)，不能用堿溶液和強(qiáng)氧化劑洗滌以免腐蝕玻璃或使比色皿粘接處脫膠。

6、測(cè)量時(shí)好從低濃度到高濃度進(jìn)行，這樣可減少誤差。